Skeletal muscle specific signalling pathways

Данные по по изменению генной экспрессии в скелетных мышцах крысы (CAGE) - исследования с вывешиванием крыс за хвост в течение 7 дней и последующим периодом реадаптации (7 дней) к нормальному уровню двигательной активности (моделирование эффектов резкого снижения мышечной активности и последующей реадаптации). Для детальной оценки динамики молекулярных изменений было проведено взятие образцов мышц (m. soleus и m. extensor digitorum longus) через 12 ч, 24 ч, 3 суток и 7 суток после начала мышечной разгрузки и начала реадаптации к нормальному уровню двигательной активности.

Выделение скоординировано регулируемых групп генов (кластеров) в скелетных мышцах крыс при атрофической разгрузке и реадаптации

Кластеры скоординированно регулируемых генов определялись по экспрессии их промоторов при помощи алгоритма “китайского ресторана”(Qin, 2006)[1], реализованного в платформе BioUML.

Данные по каждому типу мышц (m. soleus и m. extensor digitorum longus) анализировали независимо.

В результате было выделено по 15 кластеров скоординированно регулируемых генов (табл. 1.3). Для получения статистически значимых результатов в анализ включали кластеры размером не менее 100 генов.

Выделение ключевых молекул: мастер-регуляторов генной экспрессии

На следующем этапе работы были идентифицированы мастер-регуляторы, регулирующие активацию выявленных сигнальных путей в скелетных мышцах при разгрузке и при реадаптации к нормальному уровню двигательной активности (табл. 1.4). Для этого был применен метод поиска сигнальных молекул - мастер-регуляторов (Koschmann et al., 2015)[2], как было описано выше.

Построение возможных путей передачи сигнала в клетке, вовлекающих в себя выявленные транскрипционные факторы и мастер-регуляторы

На основе выявленных мастер-регуляторов групп скоординированно экспрессированных генов были найдены пути передачи клеточного сигнала, активность которых специфична для клеток мышц, при разгрузке и при реадаптации к нормальному уровню двигательной активности. Для этого к выявленным транскрипционным факторам и мастер-регуляторам был применен метод статистического обогащения биомолекул аннотациями из базы сигнальных путей TRANSPATH.

В число сигнальных путей, активируемых при вывешивании и при восстановлении после него входили: дегенерация мышц с участием γ-секретазы (Rosa de Andrade et al, 2018)[3], восстановление нормального фенотипа при дистрофии с участием белка Jagged1 (Vieira et al, 2015)[4], активация синапсов при мышечном сокращении через сигнальный путь BDNF/TrkB (Hurtado et al, 2017)[5] и активация нервной ткани при адаптации скелетной мускулатуры через сигнальный путь NGF-TrkA (Tomlinson et al, 2017) (табл. 1.3)[6]

Выделение и анализ регуляторных районов генов, с индуцибельными альтернативными промоторами

Альтернативные промоторы, индуцибельные в клетках мышечной ткани в условиях реадаптации после вывешивания, были определены в результате кластеризации стартов транскрипции эксперимента CAGE алгоритмом DPI1 (Forrest et al, 2014)[7], с использованием робастных порогов (на старт транскрипции приходится не менее 11 прочтений и его TPM-нормированный скор не менее 1), и выделения уникальных промоторов в сравнении с промоторами генома крысы, определенными в ходе проекта FANTOM5.

Всего в результате анализа данных эксперимента CAGE по реадаптации крыс после вывешивания было найдено 34644 промоторов в мышце длинного разгибателя пальцев (m. extensor digitorum longus), 14187 из которых пересекались с промоторами генома крысы из проекта FANTOM5 (найденными в различных тканях крысы в базальном состоянии), а 20457 - были уникальными для клеток m. extensor digitorum longus (обнаружены в нашем эксперименте) (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. extensor digitorum longus крысы (показано красным), с промоторами, аннотированных для генома крысы в проекте FANTOM5 (суммарные данные по разным тканям, показано синим).

Также было найдено 40632 промотора, в камбаловидной мышцы (m. soleus), 15585 из которых пересекались с промоторами генома крысы из проекта FANTOM5 (найденными в различных тканях крысы в базальном состоянии), а 25458 - были уникальными для клеток m. soleus (обнаружены в нашем эксперименте) (рис. 1.3)

Рис. 1.3. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. soleus крысы (показано красным), с промоторами, аннотированных для генома крысы в проекте FANTOM5 (суммарные данные по разным тканям, показано синим).

В промоторах активных при реадаптации в мышцах m. extensor digitorum longus и m. soleus были найдены сайты связывания транскрипционных факторов, с использованием базы данных TRANSFAC, статистически значимо обогащенные по сравнению с сайтами, найденными в промоторах, представленные в базе FANTOM5.

В силу недостаточной аннотации генома крысы (по сравнению с геном человека), найденные мотивы сайтов были аннотированы ортологичными генами человека (табл. 1.5 и 1.6)

Функциональная аннотация найденных факторов транскрипции проводилась с помощью анализа обогащения по базе данных TRANSPATH (табл. 1.7 и 1.8).

В результате анализа обогащения новых индуцибельных промоторов в m. extensor digitorum longus крысы, активированных при реадаптации после вывешивания, были выявлены процессы ассоциированные с сигнальным путем аполипопротеина E (apoE) (Kang et al, 2008)[8], активированным оксистеролом, а также с транспортом липидов, активируемым печеночным рецептором X (LXR ) (Archer et al, 2014)[9].

В результате анализа обогащения новых индуцибельных промоторов в m. soleus крысы, активированных при реадаптации после вывешивания, были выявлены сигнальные пути ядерного фактора активированных T-клеток NFAT5, управляющие миграцией и дифференцировкой миобластов при регенерации скелетных мышц (O'Connor et al, 2007)[10].

Всего в мышцах m. extensor digitorum longus и m. soleus при реадаптации было активно 46923 промотора, большинство которых - 29510 - были активны в обеих мышцах. Интересно, что количество промоторов, активных только в камбаловидной мышце (11880) более чем в два раза превышало количество промоторов, активных только в разгибателе пальцев (5533) (рис. 1.4)

Рис. 1.4. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. soleus крысы (показано красным), с промоторами обнаруженными в нашем исследовании в m.extensor digitorum longus (показано синим).

Литература

1. Qin Z.S. Clustering microarray gene expression data using weighted Chinese restaurant process. Bioinformatics. 2006. V. 22. № 16. P. 1988-1997.
2. Koschmann J., Bhar A., Stegmaier P., Kel A., Wingender E. “Upstream analysis”: an integrated promoter-pathway analysis approach to causal interpretation of microarray data. Microarrays. 2015. V. 4. № 2. P. 270-286.
3. Rosa de Andrade, I., Corrêa, S., Fontenele, M., de Oliveira Teixeira, J. D., Abdelhay, E., Costa, M. L., Mermelstein, C., γ-Secretase Inhibition Induces Muscle Hypertrophy in a Notch-Independent Mechanism. Proteomics. 2018. V. 18(3-4). doi: 10.1002/pmic.201700423.
4. Vieira NM, Elvers I, Alexander MS, Moreira YB, Eran A, Gomes JP, Marshall JL, Karlsson EK, Verjovski-Almeida S, Lindblad-Toh K, Kunkel LM, Zatz M. Jagged 1 Rescues the Duchenne Muscular Dystrophy Phenotype. Cell. 2015. V. 163(5). P. 1204-1213.
5. Hurtado E, Cilleros V, Nadal L, Simó A, Obis T, Garcia N, Santafé MM, Tomàs M, Halievski K, Jordan CL, Lanuza MA, Tomàs J. Muscle Contraction Regulates BDNF/TrkB Signaling to Modulate Synaptic Function through Presynaptic cPKCα and cPKCβI. Front Mol Neurosci. 2017. V. 10. P. 147.
6. Tomlinson RE, Li Z, Li Z, Minichiello L, Riddle RC, Venkatesan A, Clemens TL. NGF-TrkA signaling in sensory nerves is required for skeletal adaptation to mechanical loads in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. V. 114(18). P. E3632-E3641.
7. Forrest A.R., Kawaji H., Rehli M., Baillie J.K., De Hoon M.J., Haberle V., Lassmann T., Kulakovskiy I.V., Lizio M., Itoh M., Andersson R. A promoter-level mammalian expression atlas. Nature. 2014 . V. 507. № 7493. P. 462.
8. Kang J, Albadawi H, Patel VI, Abbruzzese TA, Yoo JH, Austen WG Jr, Watkins MT. Apolipoprotein E-/- mice have delayed skeletal muscle healing after hind limb ischemia-reperfusion. J Vasc Surg. 2008. V. 48(3). P. 701-8.
9. Archer A, Laurencikiene J, Ahmed O, Steffensen KR, Parini P, Gustafsson JÅ, Korach-André M. Skeletal muscle as a target of LXR agonist after long-term treatment: focus on lipid homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014. V. 306(5). P. E494-502.
10. O'Connor RS, Mills ST, Jones KA, Ho SN, Pavlath GK. A combinatorial role for NFAT5 in both myoblast migration and differentiation during skeletal muscle myogenesis. J Cell Sci. 2007 Jan 1;120(Pt 1):149-59. doi: 10.1242/jcs.03307. Epub 2006 Dec 12. PMID: 17164296.